REVISTA BIMESTRAL
ABRIL - MAYO 2018 I NUMERO 155
BIO & NANO TECNOLOGIA
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Edición génica en animales
Estado actual y perspectivas

 
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Méd. Vet. M. Sci. Nicolás Mucci
Laboratorio de producción in vitro de embriones, clonación y producción de animales genéticamente modiFIcados de EEA INTA Balcarce
 
   


Durante muchos años, las investigaciones de fisiología reproductiva en las distintas especies domésticas estuvieron orientadas a conocer los mecanismos biológicos íntimos que gobernaban estos procesos, con el objetivo final de desarrollar técnicas que permitan acelerar el progreso genético. En este contexto, se han generado biotécnicas reproductivas como la inseminación artificial, la congelación de semen, la micromanipulación de gametas y embriones, la producción in vivo e in vitro de embriones, su criopreservación y transferencia, la clonación, así como tratamientos hormonales para inducción y sincronización del celo en donantes y receptoras que garanticen que las mencionadas técnicas se cumplan con éxito. Estas técnicas, en términos generales, permiten manipular el comportamiento reproductivo animal y de este modo optimizar el uso de los recursos genéticos en beneficio de la búsqueda de las características zootécnicas deseadas.

En los últimos años, sobre la base de las biotécnicas reproductivas anteriormente mencionadas, se han desarrollado otras que permiten generar cambios en el comportamiento animal, los cuales serían imposibles de lograr de otro modo. Se trata precisamente, de la incorporación de genes (secuencias o fragmentos de ADN) que pueden incluso provenir de una especie distinta o eliminación de las mismas. Así, recientemente se han desarrollado e informado numerosos trabajos que podrían incluirse en uno de dos grandes grupos, los que tienen como objetivo incluir genes de una especie en otra para generar animales capaces de producir proteínas que normalmente no podrían (animales transgénicos) y los que se basan en anular, bloquear o eliminar uno o varios genes propios, con el objetivo de evitar la producción de proteínas específicas (animales knockout).

 
   

Las bases de la genética se encuentran sustentadas en la asociación entre el genotipo con el fenotipo. El enfoque clásico ha sido entonces identificar un fenotipo, cuyo responsable ha sido una mutación espontánea o inducida, e identificar posteriormente el o los genes responsables del mismo. Sin embargo, en los últimos años este enfoque ha cambiado hacia lo que algunos autores denominan "genética reversa" en la cual, un gen es identificado dentro del genoma y tras inducir cambios específicos en su secuencia, se evalúa y caracteriza el fenotipo resultante.

El silenciamiento de la expresión génica constituye una herramienta interesante de modificación genética de animales, la cual no ha sido abordada tan ampliamente, en comparación con la transgénesis.
Sin embargo, debido a sus potenciales resultados, representa un desafío a cubrir, debido a su posible aplicación en la salud humana, producción animal y modelo de estudio de enfermedades, entre otras cosas.

Edicion Génica

La producción de animales genéticamente modificados, que no expresen determinada proteína, es de extrema utilidad cuando se quiere obtener un producto a partir de los mismos que carezca de ciertas características indeseables. Debido a que las herramientas de biología molecular que se utilizan son extremadamente precisas, es posible en la actualidad efectuar modificaciones puntuales, quitando o agregando una o miles de bases en el ADN, sin generar perjuicios en otras regiones del genoma. Debido a ésto, y a que el ADN es un código formado por cuatro letras, es posible realizar una analogía entre estas técnicas y un procesador de textos, por lo que en los últimos años se las han denominado en términos generales como "Edición Génica".

Dentro de las herramientas disponibles para efectuar la edición génica se encuentran las Nucleasas de Dedos de Zinc (ZFN, Zinc Finger Nucleases), TALE (transcription activator-like effectors) asociados a nucleasas y denominados en conjunto TALENs (transcription activator-like effectors nucleases) y CRISPR/CAS (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins).
Las dos primeras, se basan en el diseño y construcción de proteínas que, asociadas a una endonucleasa (enzima con capacidad para cortar el ADN), son capaces de reconocer una secuencia específica y cortar las dos hebras del ADN. Si bien son relativamente efectivas, su diseño, puesta punto y construcción representan un costo en tiempo y dinero muy elevados.

A partir del año 2012, comenzaron a publicarse los primeros resultados de lo que marcaría un nuevo comienzo en la era de la biología moderna. Se trató de los primeros trabajos en los que utilizando el sistema CRISPR/CAS, conformado por una endonucleasa y una pequeña secuencia de ARN, pudieron demostrar que es posible efectuar cortes específicos en el ADN de un modo sencillo, rápido y a muy bajo costo.

El sistema CRISPR/CAS proviene de estudios iniciados en la década de los 80, en los que se observó que en el ADN de ciertas bacterias existían regiones con una estructura particular, pero sin una función conocida. Con el avance de las técnicas de biología molecular, se logró determinar que esas regiones otorgaban a las bacterias cierta resistencia al ataque de fagos (virus bacterianos). De hecho, cuando estas regiones eran removidas, las bacterias se volvían sensibles a un tipo particular de fago, mientras que si luego se les incorporaban, nuevamente recuperaban su resistencia. La región genómica asociada a estos eventos fue caracterizada y denominada como CRISPR/CAS, comprendiéndose a partir de ese momento que se trataba de un sistema inmunológico adaptativo bacteriano.

El sistema CRISPR/CAS en las bacterias funciona del siguiente modo: Cuando un fago infecta a una bacteria, bajo ciertas circunstancias, ésta efectúa cortes en los ácidos nucleicos del virus, los cuales son procesados e incorporados a las regiones CRISPRS, generando así una memoria de todos los virus con los que tuvo contacto. Cuando esa bacteria es infectada nuevamente con algún fago al que anteriormente estuvo expuesta, genera pequeños ARN mensajeros (ARNm) a partir de las secuencias previamente registradas las cuales son asociadas con endonucleasas (CAS).
En conjunto, los ARNm y las CAS funcionan como un sistema de búsqueda específica y corte, siendo el ARN el encargado de reconocer la secuencia específica del ácido nucleico del virus por complementariedad de bases, y una vez posicionado, da la orden a la CAS para que efectúe un corte.
De este modo, el virus es neutralizado rápidamente y se vuelve a reforzar al mismo tiempo la memoria inmunológica de la bacteria.

En el año 2012, se efectuó el primer informe en el que se mencionaba que, sintetizando artificialmente la secuencia de ARNm (mensajero) de un CRISPR y asociándolo a la endonucleasa CAS en un sistema in vitro, era posible efectuar cortes específicos en el ADN. Esto generó una verdadera revolución tecnológica ya que a partir de entonces, comenzó a utilizarse el sistema CRISPR/CAS para todo tipo de experimentos, no sólo en sistemas in vitro en bacterias, sino también en organismos superiores. Así, en la actualidad se dispone un sistema con el que efectuando cortes en el ADN en forma específica se pueden incorporar, anular, silenciar o modificar la actividad de uno o varios genes en especies animales o vegetales.

Específicamente, en organismos superiores la utilización de esta herramienta da como resultado que a partir del corte del ADN, la célula reclute la maquinaria de reparación del mismo, pudiendo dicha reparación ser realizada por recombinación homóloga (RH), o por unión de extremos no homólogos (UENH). En el primero se utiliza la información contenida en la cromátida hermana o en una copia extracromosómica de otra especie (introducida en forma de vector o bloque) para realizar la reparación, y de esta manera se obtiene una reparación fidedigna en donde no hay alteración en la expresión génica, o se genera un animal transgénico, respectivamente.
A través de UENH se unen directamente los extremos donde se produjo el corte, dando como resultado una eliminación o una introducción de nucleótidos, pudiendo generar un cambio en el marco de lectura del ARNm. Normalmente este tipo de transcriptos son degradados por un sistema de vigilancia de integridad del ARNm que detecta aquellos con codones stop prematuros o sin sentido, y los degrada, evitando que se generen proteínas anormales.
De este modo, se obtiene un organismo que sintetizará ARNm alterado, pero los mismos serán degradados por este mecanismo de la célula, obteniéndose el silenciamiento (knock out) del gen y la ausencia de expresión de la proteína en cuestión.

La modificación genética de bovinos productores de leche y cerdos, constituyen trabajos muy mencionados en la literatura debido al potencial que presentan sobre la salud humana.
Cada especie mamífera presenta leche con características propias que la hacen adecuada a sus crías y que la diferencian significativamente de la proveniente de otras especies. La leche de vaca contiene aproximadamente un 20% de proteínas séricas y un 80% de caseína, en cambio en la especie humana los valores son del 60% y 40%, respectivamente.

El consumo de leche bovina en los lactantes, puede generar complicaciones tanto por carecer de proteínas específicas (lactoferrina, lisozima, alfa-lactoalbúmina) como por presentar excesiva concentración de algunas otras (caseínas, β-lactoglobulina (βL)). Con respecto a la problemática particular de la carencia de pro- teínas específicas como la lisozima y la lactoferrina, el INTA y la Universidad Nacional de San Martín se plantearon como objetivo el desarrollo de un sistema de generación de animales transgénicos que permitiera, utilizando la clonación, obtener embriones portadores de dos genes humanos al mismo tiempo. Luego de producidos estos embriones se transfirieron a hembras receptoras, obteniéndose nueve meses después una hembra portadora de ambos genes. Un año más tarde, y luego de una inducción artificial de la lactancia, se logró comprobar en su leche la presencia lisozima y lactoferrina humanas por técnicas de biología molecular, un hecho inédito hasta el momento, de acuerdo a la literatura internacional.

El otro enfoque de las alteraciones producidas en lactantes tras el consumo de leche bovina, tiene que ver con la ingestión de pro- teínas que no se encuentran en la leche materna como la βL, o bien se encuentran en exceso como las caseínas. La βL, representa la fracción alergénica más sensibilizante para los niños que consumen leche de origen bovino, estimándose una incidencia comprendida entre el 2 y el 7,5%. A su vez, otros investigadores indican que su consumo aumenta 1,5 veces el riesgo de desarrollo de diabetes tipo I y ciertos tipos de neoplasias renales. Si bien ha sido posible reducir el potencial patogénico de las proteínas lácteas bovinas mediante la utilización de calor, hidrolizados enzimáticos, fermentación, etc., estos procedimiento no resultan los más apropiados para alcanzar el objetivo. En la actualidad, tanto el INTA como la Universidad Nacional de San Martín, en colaboración con la Universidad de California, se encuentran trabajando en una etapa muy avanzada, en la producción de animales editados genéticamente mediante CRISPR/CAS con capacidad para producir leche hipoalergénica.

El cerdo es considerado el biomodelo de elección para el estudio de enfermedades humanas con base genética. Así, en los últimos años se han desarrollado modificaciones genéticas en cerdos con el propósito de entender la causa y generar blancos posibles de tratamiento de un gran número de enfermedades.

Entre las más importantes pueden mencionarse la enfermedad Hungtington, Alzheimer, atrofia muscular espinal, enfermedades cardiovasculares ligadas a desordenes enzimáticos, diabetes, retinitis pigmentosa, distropia muscular y cáncer de mama. A su vez, debido a su tamaño y fisiología, representa un posible donante de órganos para aquellos pacientes en lista de espera para ser trasplantados.

La principal limitante a estos procedimientos es el rechazo inmunológico de tipo "hiperagudo", mecanismo que solo se ha documentado solo luego del trasplante de un órgano porcino a un receptor primate. Existen al menos dos enfoques posibles para sobrepasar este proceso de rechazo. Por un lado, modificar genéticamente los cerdos para permitir que sus órganos no generen la respuesta inmunológica mencionada. Por el otro, producir cerdos que a su vez, desarrollen órganos humanos.

Mediante técnicas de biología molecular, se ha determinado que ciertos genes son responsables directos o indirectos del desarrollo de determinados órganos en mamíferos superiores. A través de la generación de Knockouts específicos, es posible anular un linaje celular y de este modo, prevenir su contribución en la formación de un órgano o tejido.

De este modo, podría considerarse que queda un "hueco" o "nicho" en dónde podrían colocarse células para promocionar su diferenciación hacia el órgano o tejido faltante. Es aquí donde la complementación embrionaria juega un rol preponderante ya que si a estos embriones modificados genéticamente, a los que se les anula el gen responsable del desarrollo de un órgano específico, se les inyectasen células pluripotentes de otro, el origen celular del órgano que surja corresponderá a estas últimas células y no al animal que lo contiene. En esta línea, ya se han informado varios trabajos en distintos grados de avance, pero seguramente por cuestiones de regulación o bioética, tardarán varios años en poder llegar a alguna fase clínica de utilización en humanos.

Puede concluirse que la edición génica, en conjunto con otras biotécnicas reproductivas, constituye una poderosa herramienta para ser utilizada con fines de estudio, producción animal e incluso en salud humana.