REVISTA BIMESTRAL
DICIEMBRE 2019 - ENERO 2020 I NUMERO 165
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Cómo combatir el
picudo del algodonero
El INTA desarrolla metodologías biotecnológicas para el control de la plaga


 
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Dra. Dalia Lewi
M.N. 17349*01*01

Grupo de Transformación Genética del Instituto de
Investigación Genética, INTA.
 
   

En el marco de un inédito convenio entre el INTA y cuatro provincias algodoneras, se obtuvieron plantas transgénicas de algodón y eventos con secuencias específicas para generar resistencia al picudo mediante silenciamiento génico. Es la primera vez que se logra este desarrollo en el país, y se continúa trabajando para lograr un efectivo control de la plaga.

El picudo del algodonero (Anthonomus grandis Boheman) es la plaga más importante de este cultivo en Argentina, Brasil, Colombia y Paraguay. La presencia sostenida año tras año de este coleóptero produce daños por las dificultades para su control, el aumento de costos de producción y los perjuicios ambientales y sociales que provoca. En efecto, este insecto plaga produce el daño en el botón floral, ovipone dentro de la bocha, las
larvas nacen dentro y se alimentan del contenido del fruto en desarrollo, lo que provoca la pérdida de la fibra y la disminución del rendimiento. Al quedar protegido dentro de la flor, la efectividad de los agroquímicos es relativa, por lo que la aplicación intensiva de insecticidas no es totalmente efectiva, además de las consecuencias ambientales que implica el uso excesivo de estos productos. El adulto, además, encuentra refugio en las zonas donde la luz penetra menos en el cultivo, también entre las brácteas, y puede completar un ciclo completo en 20 días, lo que implica varias generaciones por cultivo y un aumento exponencial de la población plaga. Un Convenio oportuno para una plaga muy dañina

 
 

Con el objetivo de “Adquirir conocimientos para el desarrollo de estrategias biológicas no contaminantes para el control del picudo del algodonero”, en 2009 se firmó un convenio que vincula las provincias algodoneras de Chaco, Formosa, Santiago del Estero y Santa Fe, con el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). En sus inicios este convenio fue inédito en su tipo debido a que se constituyó atendiendo a la demanda que los productores de algodón hicieron llegar a las autoridades de los Gobiernos provinciales y al INTA. Este Convenio se sostiene con los aportes de las Provincias provenientes de la Ley 26060 “de la promoción del Algodón” y los recursos humanos e infraestructura de INTA y es Coordinado por un Comité conformado por representantes de las Provincias y profesionales de INTA: Juan Carlos Salerno (Instituto de Genética), Diana Piedra (Directora del Centro Regional Chaco- Formosa), Ruth Heinz (Directora del CICVyA) y el actual Coordinador de Vinculación Tecnológica, Germán Linzer.

En el marco del Convenio se están desarrollando diferentes abordajes para el control de la plaga, considerando la aplicación de distintas técnicas tales como el sistema push-pull utilizando y desarrollando trampas que contengan conjuntamente atrayentes y repelentes, la formulación de micoinsecticidas para utilizarse como control biológico, el silenciamiento génico mediante ARN de interferencia, la transgénesis y el mejoramiento genético convencional para la obtención de variedades con mayor tolerancia a la plaga.
Con cada una de estas tecnologías se están obteniendo avances. Por ejemplo, se ha desarrollado una trampa de diseño novedoso “trampa TOMI” (Iván Bonasic, EEA Sáenz Peña). Se logró un formulado a base de hongos entomopatógenos que está siendo evaluado para ser llevado al ámbito productivo (Roberto Lecuona, IMYZA), se obtuvo una variedad con brácteas con morfología diferente “bráctea frego” que impiden el refugio de los adultos (Mauricio Tcach, EEA Sáenz Peña).

El logro de las plantas transgénicas

Para la obtención de plantas transgénicas de algodón para resistencia al picudo en INTA se desarrollan actividades en el Instituto de Genética y en la EEA Sáenz Peña. Primero tuvimos que ajustar el sistema de trasferencia génica, es decir, lograr que el protocolo para obtener plantas transgénicas funcione en las condiciones de trabajo de nuestro laboratorio. Como punto de partida elegimos el protocolo publicado por Dr Rathore, de la Universidad de Texas A&M, utilizando genotipos que, según la bibliografía, responden al cultivo in vitro. El protocolo consiste en tratar secciones de hipocótiles de un centímetro de largo obtenidos de plántulas de 7 a 10 días de germinación. Estos “explantos” se ponen en contacto con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene el plásmido (molécula circular de ADN) con las secuencias que queremos introducir en las células del algodón.

 
 

Una vez completados los 3 días de cocultivo, los explantos se pasan a un medio con reguladores de crecimiento que inducen la formación de “callos” (tejidos desdiferenciados donde las células se multiplican sin seguir un patrón determinado). El objetivo del cultivo in vitro en este caso es lograr que esos callos, además de haber sido transformados, sean embriogénicos. La embriogénesis somática – término que refiere a la capacidad de generar embriones no cigóticos en un contexto celular- se logra modificando las relaciones de los reguladores de crecimiento en los medios de cultivo.

Estos embriones, una vez que empiezan a diferenciarse del resto del callo, inician su camino hacia la bipolaridad y atraviesan todos los estadios de los embriones cigóticos, con la diferencia que no se están formando en una semilla sino en el contexto de un callo que los rodea. Este paso fue un cuello de botella para nuestro trabajo, pero finalmente pudimos ajustar todas las variables para que ocurra. Una vez formados los embriones, se los individualiza y se los cultiva en medios para que continúen su desarrollo y formen una plántula. Luego se avanza hacia el traslado de las plántulas a macetas y se las dispone en un invernáculo de bioseguridad.

Las investigadoras involucradas en los ensayos de transformación genética son Ariela González (EEA Saenz Peña), Mariana Turica y Laura Maskin (Instituto de Genética) y quien suscribe, como responsable de este módulo del Convenio. Además del protocolo descripto más arriba, también se está trabajando en el desarrollo de protocolos alternativos para disminuir el período de tiempo de cultivo in vitro y generar un sistema que sea independiente del genotipo utilizado como base para la transformación.
Como se trata de plantas transgénicas, deben manejarse cumpliendo las normativas vigentes para materiales regulados. En nuestro país existe un marco regulatorio que indica cómo debe ser el manejo de materiales transgénicos, solicitando los permisos -tanto para experimentación como para la evaluación para su futura aprobación- por la autoridad competente (Res. 36/19 y la Res. 44/19 de la Secretaría de Alimentos y Bioeconomía del actual MAGyP).

El mecanismo de ARN de interferencia (ARNi)

El mecanismo elegido para matar al insecto plaga está basado en la ingestión oral de ARN doble cadena (ARNdc) que induce el silenciamiento génico. Mediante pirosecuenciación, el grupo de Ricardo Salvador (IMYZA) y Esteban Hopp (Instituto de Biotecnología) obtuvo información genómica inédita de miles de genes de este insecto que se expresan efectivamente en su organismo (llamada “transcriptoma”). Esta información permitió seleccionar genes esenciales para la sobrevida de la plaga y de esta forma utilizarlos como blancos del silenciamiento para bloquear su expresión.

 
 

La estructura molecular de los vectores utilizados para la transformación genética del algodón y generar el efecto esperado en este coleóptero, consiste en dos copias contiguas, insertadas en sentidos opuestos, de una porción del gen elegido de picudo, el cual es vital para su correcto funcionamiento celular. Como resultado de la transcripción de la secuencia que contiene ambos fragmentos invertidos, se produce una molécula de ARN que se pliega sobre sí misma, generando un ARNdc con una secuencia complementaria al ARN mensajero (ARNm) blanco del gen elegido que se expresa en la plaga. Se espera que cuando la planta de algodón portadora del evento sea ingerida por el coleóptero, el ARNdc pase junto con el material vegetal a través del tracto digestivo e ingrese en las células del insecto. Una vez en el citoplasma, la maquinaria celular procesará al ARNdc en fragmentos de 21 nucleótidos complementarios al gen blanco.

La presencia del ARNdc es una señal reconocida, amplificada y transmitida en forma sistémica al resto del organismo culminando con el silenciamiento del gen blanco, mediado por el mecanismo de ARNi y llevando al insecto blanco a la muerte o a una disminución de su ritmo metabólico. De esta manera se espera que se retrase su desarrollo, lo incapacite para generar descendencia y consecuentemente disminuya el daño.

En paralelo a la transgénesis de algodón se realizaron ensayos en laboratorio en los cuales se probó la eficacia del ARNdc sintetizado en bacterias y aplicado en la dieta de los picudos. En éstos pudo observarse una muerte significativa de insectos, pasando luego a una prueba de expresión transitoria dentro de la planta de algodón. Para esto último, se obtuvieron construcciones (en virus que inducen el silenciamiento génico - VIGS) que permiten la síntesis de ARNdc específico del picudo del algodonero en plántulas de algodón. Se pudo demostrar que la expresión en algodón de ARNi es capaz de inducir el descenso de la expresión del gen blanco en larvas de A. grandis.

Hemos dado un gran paso

Los próximos pasos consistirán en desafiar los eventos obtenidos contra el picudo del algodonero en una forma y cantidad adecuada para lograr un efectivo control del mismo.
Los resultados obtenidos hasta el momento son muy alentadores, ya que se han obtenido plantas transgénicas conteniendo las secuencias para generar ARN de interferencia y silenciar genes específicos del picudo del algodonero (ver apartado sobre ARN de interferencia). Éstas constituyen la primera camada de eventos, ya que se continúa trabajando para la obtención de los siguientes que contendrán combinaciones de varias secuencias específicas.

Los siguientes pasos del proyecto además consistirán en evaluar a campo los eventos (solicitando los correspondientes permisos) y desafiarlos con el picudo para determinar la eficacia. Asimismo, se espera introgresar los eventos en fondos genéticos del Plan de Mejoramiento de Algodón de INTA, para obtener la expresión contra el picudo en materiales de alto rendimiento y calidad mejorada.